共聚焦顯微鏡的共聚焦成像能有效抑制焦平面外的雜散光和非測量光進入探測器，實現單一焦層面成像，使分辨率大為提高。載物臺沿橫向均勻移動時，可形成清晰的單層圖像，沿縱向移動，可實現樣品不同深度的逐層掃描，經過三維重建得到樣品的三維立體結構，即所謂的“光學CT”。因為，光通過濾鏡的數目減少，其光學穿透有效率更高，影像更為鮮明，解析更高。
共聚焦顯微鏡主要組成包括：顯微鏡、激光光源、掃描裝置、檢測器、計算機系統(包括數據采集，處理，轉換，應用軟件)、圖像輸出設備、光學裝置和共聚焦系統。
激光器：隨著激光技術的飛速發展，共聚焦顯微鏡可以根據研究需要選擇不同的激光器。
照明針孔：照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的。激光經照明針孔形成點光源，相干性好，頻率、振動方向、相位高度一致。
光束分離器：從樣晶上反射和散射的光與熒光束混合在一起，所以需要用光束分離器將激發和釋放光束分開。
物鏡：選大數值孔徑平場復消色差物鏡為好，有利于熒光的采集以獲得更清晰的成像。
焦平面：激光點光源照射標本，在焦平面處聚焦，激發熒光標記的樣本發射熒光，形成焦點光斑。該光斑經過物鏡、光束分離器等一系列裝置的處理，分別在照明針孔及探測器針孔兩處聚焦，共聚焦的含義由此而來。
探測器針孔：起到空間濾波器的作用。大限度地阻礙非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦點斑以外的散射光，以保證探測器針孔所接受到的熒光信號全部來自于樣品光斑焦點位置，因此樣品上衍射聚集光斑和探測器針孔成像光斑包含相同信息。
探測器：用光靈敏度*、響應速度極快的電倍增管(PMT)檢測激發熒光，轉變為電信號傳輸至計算機，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像。
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